CRISPR专利申请浅析

1.背景

CRISPR/Cas系统的发现可以追溯到1987年，研究者在大肠杆菌的基因组中首次发现了这一奇特的重复间隔序列^[1]，随后在细菌和古细菌中被大量发现。2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。

CRISPR/Cas系统是大部分细菌和古细菌中用来对抗外来核酸/噬菌体入侵的一种免疫系统。CRISPR/Cas系统最典型的特征是由CRISPR系统相关蛋白(Cas)，重复序列(repeats)，间隔序列(spacer)组成，重复序列和间隔序列交替排列。当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒再次入侵时，CRISPR转录、加工形成crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切割，从而对抗外源核酸入侵。

(CRISPR-CAS系统的自适应免疫^[2])

CRISPR系统根据基因的保守性和基因座的组织形式分为了三种类型，即Type I，Type II和Type III型^[3]，每个类型中又可以分为几种小类。目前广泛应用的CRISPR/Cas9系统属于2类Ⅱ型CRISPR/Cas系统，该系统结构简单，仅由crRNA、tracrRNA和Cas9三种成分组成。根据tracrRNA与crRNA的结构特性，科学家们将tracrRNA和crRNA组合为一条嵌合的向导RNA(guide RNA，gRNA)，使得CRISPR/Cas9系统进一步简化为只有gRNA和Cas9这2种组分的系统。

CRISPR/Cas系统已广泛应用于基因治疗、转基因生物构建、药物筛选等多个领域，推动了生物医学的发展。2020年3月，Editas Medicine和Allergan 共同宣布，临床试验完成了首例患者体内给药，其疗法AGN-151587也是全球首款在患者体内给药的CRISPR基因编辑疗法。

2.CRISPR技术专利申请趋势

2.1申请数量

CRISPR技术自发现以来，专利申请一直处于缓慢发展的阶段。2012年，Jennifer Doudna与Emmanuelle Charpentier合作，发现了一个简单的CRISPR/Cas系统，它通过Cas9核酸内切酶以及以CRISPR序列为模板转录出来的两种RNA就可以剪切dsDNA，将CRISPR/Cas9 改造成为可高效实现精准修饰靶基因特定DNA序列的工具。自此，CRISPR作为新生代的基因编辑技术，其研究热潮迅速席卷全球，专利申请数量也大幅度攀升。

(CRISPR专利申请量变化^[4])

2.2主要申请人

目前，CRISPR/Cas系统的主要研发团队包括Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、张峰等，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier首次提出了CRISPR/Cas系统对DNA的靶向编辑功能，并进行相关专利申请；随后张锋等率先开发出了可在真核细胞中进行基因编辑的CRISPR/Cas系统，并且及时申请了专利。

自此之后，张锋课题组又先后发现了新型基因编辑工具CRISPR/Cas12a(旧称CRISPR/Cpf1)，具有较高的基因编辑能力；同年，张峰课题组发布了来自于细菌的CRISPR/C2c2系统，后命名为CRISPR/Cas13a系统，并发现其对RNA有剪切功能。

CRISPR技术的全球专利主要申请人可见表1，其中麻省理工学院、哈佛大学、博德研究所为主要申请人，张峰作为Broad研究所(Broad Institute)教授，并创办了Editas Medicine公司，其对CRISPR相关专利申请量远高于其他发明人。

表 1

序号	申请人
1	Massachusetts Institute of Technology（美）
2	Harvard University（美）
3	Broad Institute（美）
4	中国科学院（中）
5	University of California（美）
6	Editas Medicine（美）
7	GE Healthcare（美）
8	DuPont Pioneer Hi-bred（美）
9	CRISPR Therapeutics（美）
10	浙江大学（中）

2.3 技术领域

CRISPR相关专利的应用领域涵盖医学、农业和工业领域，其应用范围广，其中医学是最大的应用领域，包括遗传、癌症等疾病治疗，以及新药开发等相关领域。在申请技术领域方面，如下IPC分类中占据比较大的申请比例：C12N9/22(核糖核酸酶)、C12Q1/68(包括核酸)、C12N15/113(调节基因表达的非编码核酸，如反义寡核苷酸)，以及A61K48/00(含有插入到活体细胞中的遗传物质以治疗遗传病的医药配制品；基因治疗)、C12N15/90(将外来DNA稳定地引入染色体中)、C12N15/85(用于动物细胞)等。目前，CRISPR相关专利多关注于Cas蛋白改造，gRNA设计、基因结构改造、定向修饰，基因表达调控等。

2.4 技术主题

CRISPR相关专利申请具有主题类型丰富、可布局方式多样等特点，下图示出了目前CRISPR专利申请中主要的技术主题类型：

(CRISPR专利申请主题)

Cas蛋白与gRNA是CRISPR专利申请中占比最高的两类技术主题。在涉及Cas蛋白的专利申请中，以Cas9蛋白为技术主题的专利申请占据主要的申请比例，此外以新发现的Cas12a、Cas13等Cas蛋白为技术主题的申请量也逐渐增多。其中，由于Cas12a蛋白与crRNA、目标核酸链结合后，可释放对ssDNA的切割活性，拓展了CRISPR技术在核酸检测领域的专利申请。

利用Cas蛋白的核酸酶活性部分丧失或全部丧失的突变体（例如，Cas9n、dCas9等）开发有一系列新型的编辑系统，例如Cas9n、dCas9与脱氨酶等蛋白融合，可用于构建对单碱基编辑的碱基编辑器。在以碱基编辑器为技术主题的专利申请中，哈佛大学、Broad研究所、比姆医疗公司等占据申请优势。

gRNA或crRNA、tracrRNA是构成CRISPR系统的重要内容，gRNA、crRNA、tracrRNA的优化与设计对于改善脱靶率、改良编辑效率等具有积极作用，是CRISPR专利申请中的另一长期布局重点。

2.5 专利纠纷

在CRISPR技术快速发展的同时，其专利权的纠纷也随之而来。2012年5月，加州大学的Jennifer Doudna等提交了关于CRISPR/Cas9基因编辑技术的专利申请，同时在申请中描述了CRISPR/Cas9在细菌等原核生物中的应用情况。2012年12月，张锋基于真核细胞内的CRISPR/Cas9技术申请专利，虽然申请时间较前者晚7个月，但张锋所在的Broad研究所通过专利申请加速程序于2014年4月15日优先通过专利审查，首次获得CRISPR/Cas9的专利授权。

2016年，加州大学以“专利冲突”为由，针对Broad研究所的CRISPR基因编辑专利，以及另外11件相关专利向美国专利商标局专利审判和上诉委员会(PTAB)请求启动抵触审查程序，以确认谁先发明了CRISPR基因编辑技术。2017年，PTAB认为方专利不存在事实上的干扰，双方持有的专利涉及不同主题的发明，判定双方保留各自专利。随后，加州大学正式向联邦巡回上诉法院(CAFC)递交上诉，指出因编辑原始应用覆盖了所有细胞、植物、动物和人类，不止局限于细菌。2018年9月份，CAFC最后裁定维持美国专利审判与上诉委员会的判决，Broad研究所将继续拥有在真核生物中使用CRISPR基因编辑的知识产权^[5]。

2022年2月4日，PTAB进行了专利听证会，双方就Broad研究所是否以不正当方式获取CRISPR的早期技术信息，以及用于真核细胞中编辑的gRNA的归属问题展开争论，但目前尚未给出定论。

3. 总结

目前，围绕CRISPR核心专利的权利纷争尚未定论，而加州大学与维也纳大学团队以及Broad研究所团队已经分别将CRISPR相关专利授权给多家生物、医药公司；在CRISPR核心专利的权利归属明确后，势必有一些引进单方团队专利的公司将面临巨大的经济损失。

因此，如何围绕CRISPR/Cas技术的核心改进点，结合外围专利策略，在CRISPR 系统、Cas蛋白、gRNA、PAM及相关方法、应用等方面进行全面考量，合理统筹、布局，是未来CRISPR/Cas技术研发、商业应用过程中需要考虑的重要问题。

参考文献：

[1]Y Ishino, H Shinagawa, K Makino, M Amemura, A Nakata . Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product. J Bacteriol. 1987 Dec; 169(12):5429-33.

[2]Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.

[3]Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Wolf YI, Yakunin AF, van der Oost J, Koonin EV. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011. Jun;9(6):467-77.

[4]https://www.ipstudies.ch/crispr-patent-analytics/

[5]何隽,张虹颖. 专利诉讼与研发活动对科技公司影响的实证研究[J]. 科技管理研究, 2020, 40(6).

（2022年）